El modelo de interacción planta-patógeno de Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pst) se ha utilizado ampliamente para entender los procesos celulares y moleculares en la interacción de las plantas con bacterias patógenas (Xin & He, 2013). Los síntomas que desarrollan las plantas a causa de la infección por Pst se presentan como regiones de necrosis localizada rodeadas de zonas cloróticas, las cuales son más evidentes en las etapas finales de la infección.
El reconocimiento de la bacteria a través de las moléculas asociadas a su estructura (PAMPs por sus siglas en inglés) por receptores específicos de la membrana celular de la planta, desencadena diversas respuestas moleculares y bioquímicas en la célula vegetal, que tienen un impacto en la inmunidad innata de la planta. La producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) como el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el anión radical superóxido (O2.-) son parte fundamental en la defensa de la planta en contra de patógenos como Pst. La producción de EROs es el resultado de la actividad de diferentes enzimas, como las peroxidasas de clase III de la pared celular, la enzima RBOH, las amina oxidasas dependientes de cobre (DAOs) y las poliamina oxidasas dependientes de flavina (PAOs), entre otras (Camejo et al., 2016; Kámán-Tóth et al., 2019).
Las poliaminas (PAs) son aminas alifáticas de bajo peso molecular, con importantes funciones moleculares y fisiológicas. En las plantas, las PAs participan en la regulación del crecimiento, el desarrollo y la respuesta al estrés de tipo biótico y abiótico (Tiburcio et al., 2014). Las principales PAs son la diamina putrescina (Put), la triamina espermidina (Spd) y las tetraaminas espermina (Spm) y termospermina (tSpm). Los niveles de acumulación celulares de PAs están estrechamente regulados mediante su biosíntesis, catabolismo, conjugación a ácidos hidroxicinámicos y transporte (Baron & Stasolla, 2008). Los miembros de las familias multienzimáticas DAO y PAO, son responsables del catabolismo de las PAs, cada enzima tiene afinidad específica por cada poliamina.
En Arabidopsis, las DAOs se localizan en el espacio extracelular y en los peroxisomas, y participan en la oxidación de Put y Spd, produciendo aminoaldehídos, amoníaco y H2O2 (Planas-Portell et al., 2013). Las PAOs oxidan a las PAs superiores como Spd, Spm y tSpm, por catabolismo terminal, o a través de catabolismo de retroconversión. El catabolismo terminal de Spd y Spm implica la oxidación del carbono en el lado-endo del nitrógeno N4, con la producción concomitante de aminoaldehídos, 1,3-diaminopropano (1,3-Dap) y H2O2. En el catabolismo de PAs por retroconversión, se oxida el carbono del lado-exo del nitrógeno N4 de Spd y Spm produciendo Put y Spd, respectivamente, junto con 1,3-Dap y H2O2 (Moschou & Roubelakis-Angelakis, 2013; Moschou, Sanmartin, et al., 2008).
En A. thaliana se han identificado cinco genes que codifican para PAOs. AtPAO1 y AtPAO5 se localizan en el citosol, mientras que AtPAO2, AtPAO3 y AtPAO4 son enzimas peroxisomales (Bordenave et al., 2019; Takahashi et al., 2010). En Arabidopsis se han identificado diez genes que codifican para proteínas RBOH. La enzima RBOH, es una enzima transmembranal y está implicada en la producción de O2.-, el cual dismuta a H2O2 espontáneamente o a través de la acción de la enzima superóxido dismutasa (SOD) (Liu & He, 2016). Las enzimas AtRBOHD y AtRBOHF son importantes para la producción de EROs en respuesta al ataque de patógenos y para desencadenar la señalización que tiene como objetivo generar una muerte celular programada.
Durante la interacción Arabidopsis-Pst, se produce de forma rápida EROs como efecto de la respuesta inmune mediada por PAMPs la cual desencadena la activación de diferentes cinasas como las cinasas de proteína activadas por mitógeno (por sus siglas en inglés MAPK). Esta producción primaria depende principalmente de la activación de AtRBOHD, lo que tiene un efecto en el cierre estomático, la biosíntesis de lignina y la deposición de callosa, como mecanismo de defensa para evitar que el patógeno prolifere (Liu & He, 2016). Derivado del catabolismo de PAs se genera como producto el H2O2, el cual se ha demostrado que es importante en la defensa de la planta ante el ataque de patógenos. La inhibición de la actividad PAO por el compuesto 1,19-bis(etilamino)-5,10,15-triazanonadecano (SL-11061), tuvo como efecto una mayor susceptibilidad de Arabidopsis a la infección por Pseudomonas viridiflava (Gonzalez et al., 2011).
Por lo tanto, se sugirió que la defensa de la planta depende del aumento de los niveles de H2O2 derivados de la oxidación de Spm, lo que implica que el catabolismo de PAs es un componente esencial de la respuesta de defensa (Gonzalez et al., 2011). En este trabajo se analizó el rol de los genes AtPAO1 y AtPAO2 en la interacción Arabidopsis-Pst. Se analizaron los perfiles de expresión de los cinco genes AtPAO encontrando que la expresión de los genes AtPAO1 y AtPAO2 se encuentra aumentada en las hojas de plántulas de Arabidopsis de tres semanas de edad infectadas con Pst a las 24 hpi. La regulación transcripcional de los genes PAO se ha observado en diferentes tipos de interacciones planta-patógeno. Este estudio, se enfoca en la importancia de la expresión de los genes PAO en respuesta al estrés biótico, en particular en el análisis de los genes AtPAO1 y AtPAO2 en la interacción hemibiotrófica Arabidopsis-Pst. Además, se determinó la actividad PAO, encontrando cambios en las plántulas de A. thaliana (Col-0) infectadas con Pst. A las 24 hpi se detectó una disminución en la actividad de oxidación de Spm y posteriormente, un incremento de la oxidación de esta PA a las 48 hpi.
Por otro lado, al analizar los niveles de PAs, se observó un aumento en los niveles de Put en plántulas de A. thaliana infectadas con Pst, sin embargo no se encontraron diferencias significativas en el contenido de PAs superiores (Spd y Spm). Por lo tanto, de acuerdo a los resultados antes mencionados se sugiere que el aumento de la actividad PAO a las 48 hpi en plántulas de Arabidopsis infectadas con Pst, puede ser responsable del incremento de Put en los tejidos infectados a través del catabolismo de retroconversión. A partir de a los resultados obtenidos respecto a la expresión de los genes AtPAO, se decidió analizar a las líneas mutantes Atpao1-1, Atpao2-1 y una línea doble mutante Atpao1-1 x Atpao2-1. Se analizó primero las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) para determinar la susceptibilidad o resistencia hacia Pst. En tanto, se encontró una mayor susceptibilidad en la línea doble mutante Atpao1-1 x Atpao2-1, y sorprendentemente, la línea mutante Atpao1-1 mostró resistencia a Pst. Acorde al fenotipo de infección observado en las líneas mutantes, se decició medir los niveles de EROs, debido a que el H2O2 es uno de los productos derivados del catabolismo de PAs. Por otro lado, también se decidió analizar la actividad enzimática de RBOH, catalasa (CAT) y SOD en las líneas mutantes infectadas y no infectadas por Pst.
Los resultados mostraron que la actividad enzimática RBOH se incrementó en las líneas mutantes con y sin infección respecto al ecotipo silvestre. También se observó que las actividades CAT y SOD aumentaron en la línea mutante Atpao1-1 durante la interacción con Pst. Además, se analizaron los cambios en los niveles de expresión de los genes AtRBOHD, AtRBOHF, y de los genes AtPRX33 y AtPRX34, los cuales codifican para peroxidasas de pared, en las líneas mutantes en interacción con Pst. Se observó principalmente el aumento de la expresión de estos cuatro genes en la línea mutante sencilla Atpao1-1 a las 72 hpi. Los resultados obtenidos sugieren que las alteraciones en el catabolismo de PAs afectan los niveles de EROs y las actividades de las enzimas RBOH y CAT, por lo tanto, la defensa de la planta se compromete, sugiriendo un vínculo entre el catabolismo de PAs (principalmente de la Spm) y otras enzimas implicadas en la homeostasis de las EROs. De lo anterior se propone un modelo para la participación del catabolismo de PAs en la interacción Arabidopsis-Pst.
En primer lugar, la percepción de Pst por parte de los receptores de la planta conduce a la activación de enzimas (RBOH) y vías de señalización mediadas por MAPK que inducen la producción de EROs, la expresión de genes de defensa y la síntesis de moléculas de respuesta a patógenos. Los genes AtPAO1 y AtPAO2 se expresan en respuesta a Pst, por lo tanto, su expresión es importante ante la infección, seguramente contribuyendo a una mayor oxidación de PAs en el citoplasma (AtPAO1) y en el peroxisoma (AtPAO2) mediante el catabolismo terminal o catabolismo de retroconversión. Ambas vías catabólicas conducen a la producción de H2O2; por lo tanto, la actividad PAO podría tener un impacto diferencial en la expresión génica y en las respuestas de defensa dependiendo del sitio intracelular donde se genere el H2O2. Por otra parte, la hipótesis propuesta es que las enzimas PAO podrían contribuir a aumentar los niveles de Put a través del catabolismo de retroconversión de Spm.
La acumulación de Put ha sido reportada en la interacción Arabidopsis-Pst, y puede lograrse por biosíntesis de novo, así como por excreción bacteriana de Put durante la colonización de la planta. En el caso de las líneas mutantes Atpao, los niveles de Put se encuentran aumentados. La disminución de la oxidación de PAs en citoplasma y peroxisoma en las líneas mutantes Atpao1-1 y Atpao2-1 afecta al contenido de EROs. En particular, la producción de O2.- derivada de la actividad de la RBOH, y la consiguiente producción de H2O2. Por lo tanto, se propone que la oxidación intracelular de Spm por PAOs puede regular negativamente la actividad de RBOH en las plántulas WT, por un mecanismo desconocido que podría implicar la señalización de H2O2.
http://repositorioinstitucional.uaslp.mx/xmlui/handle/i/7414